欣谕仪器：冷冻干燥过程研究

 1 产品预冻 

1.1 制品的玻璃化

玻璃化的作用。近年来，人们已经逐渐地认识到，凡是成功的低温保存，细胞内的水均以玻璃态的形式被固化，在胞内不出现晶态的冰。玻璃化是指物质以非晶态形式存在的一种状态，其粘度极大，分子的能动性几乎为零，由于这种非晶体结构的扩散系数很低，故在这种结构中分子运动和分子变性反应非常微弱，不利的化学反应能够被抑制，从而提高被保存物质的稳定性。

玻璃化的获得。在产品预冻时，只要降温速率足够快，且达到足够低的温度，大部分材料都能从液体过冷到玻璃态固体。“足够快”的意思是在降温过程中迅速通过结晶区而不发生晶化，“足够低”指的是必须把温度降到玻璃化转变温度Tg以下。

对于具有一定初始浓度的细菌制品，其预冻过程一般通过“两步法”来完成。第一步是以一般速率进行降温，让细胞外的溶液中产生冰，细胞内的水分通过细胞膜渗向胞外，胞内溶液的浓度逐渐提高；第二步是以较高速率进行降温，以实现胞内溶液的玻璃化。此法又称“部分玻璃化法”。

 当初始浓度为A的溶液（A点）从室温开始冷却时，随着温度的下降，溶液过冷到B点后将开始析出冰，结晶潜热的释放又使溶液局部温度升高。溶液将沿着平衡的熔融线不断析出冰晶，冰晶周围剩余的未冻溶液随温度下降，浓度不断升高，一直下降到熔融线(Ta)与玻璃化转变曲线(Tg)的交点(D点)时，溶液中剩余的水分将不再结晶(称为不可冻水)，此时的溶液达到最大冻结浓缩状，浓度较高，以非晶态的形式包围在冰晶周围，形成镶嵌着冰晶的玻璃体。

  1.2降温速率与预冻温度

预冻速度决定了制品体积大小、形状和成品最初晶格及其微孔的特性，其速度可控制在每分钟降温1℃左右。

对结晶性制剂而言，冻结速度一般不要太慢，冻结速度慢虽然便于形成大块冰晶体，维持通畅的升华通道，使升华速度加快，但如果结晶过大、晶核数量过少、制剂的结晶均匀性差，也不利于升华干燥。对于一些分子呈无规则网状结构的高分子药物，速冻能使其在药液中迅速定型，使包裹在其中的溶媒蒸汽在真空条件下迅速逸出，反而能使升华速度加快。因此，溶液的最佳冷冻速度是因制剂本身的特性不同而变化的。如蛋白多肽类药物的冻干，慢速冻结通常是有利的，而对于病毒、疫苗来说，快速降温通常是有利的。20世纪60年代，人们成功地保存了哺乳动物的某些细胞，其降温程序是：以1℃/min降到-15℃，然后以4-5℃/min降到-79℃，这一程序与前面所提及的“两步法”是一致的。但也有降温更慢和更快的事例，如红细胞和仓鼠细胞的最佳冷却速率超过50℃/min，而保存淋巴细胞的降温速率只有0.1℃/min。

预冻温度须低于制品的玻璃态和橡胶态转变温度，以保证箱内所有的制品温度都低于共熔点，使其全部凝结成固体；对于许多溶液，它们的玻璃化转变温度一般要比共晶点低10-30°。至于预冻的最终温度是控制在低于共晶温度还是低于玻璃化转变温度，这主要取决于我们希望制品在冻结过程中所达到的固化状态。对于具有类似膜结构或活性成分制品的冷冻干燥，应尽量使其最终冻结温度低于玻璃化转变温度。一般制品预冻温度在共熔点以下10-20℃保持2-3h，保证冷冻完全；多数疫苗的共熔点在-15℃到-20℃之间，因此预冻温度要在-25℃到-40℃。目前最常用的一种冷冻方法是冻干机板层冷冻。

 2一次干燥 

一次干燥（升华干燥）是指低温下对制品加热，同时用真空泵抽真空，使其中被冻结成冰的自由水直接升华成水蒸气。待成品中看不到冰时，则可认为一次干燥已完毕，此时制品温度迅速上升，接近板温，制品中最初水分的90%以上已被除去。

2.1一次干燥中制品温度的控制

在升华干燥过程中，制品吸收热量后所含水分在真空下升华成水蒸气，消耗大量热能，使得制品温度较板层温度低十几甚至几十度。多数动物用疫苗一次干燥应在-30℃或以上温度（低于产品塌陷温度尤其是共熔点温度）下进行，因此板层温度一般在-10～-3℃之间。如果温度过高，会出现软化、塌陷等现象，造成冻干失败；如果温度过低，不仅给制冷系统提出了过高的要求，而且大大降低了升华过程的速率，费时又耗能。尽管在有些场合下，一次干燥的最大许可温度由制品的相变温度或共晶温度决定，但更一般的情况下，预冻的制品中都有一定份额的无定形态，故应当将冻干的一次干燥过程控制在Tg以下进行。

在干燥过程中，如制品干燥层温度上升到一定数值时，其部分干燥物质所形成的多孔性骨架刚度降低，干燥层内颗粒出现脱落，直至骨架塌陷，造成已被干燥部分的微孔通道被封闭，阻止升华的进行，使升华速率减慢，最终可导致冻干产品的残余水分含量过高，产品的复水性与稳定性差。此时的温度称为塌陷温度Tc。塌陷温度Tc是在冻干过程中样品所特有的特征温度，是由制品材料及干燥层的多孔性结构所决定。有人认为，在多数情况下，塌陷温度Tc要比玻璃化转变温度Tg高20°左右。对于一个特定的冻干制品，其共晶温度、玻璃化转变温度可通过DSC（差式扫描量热法）测得，而塌陷温度可通过冻干显微镜和介电分析测得。

目前大多数的操作，都是在整个升华干燥过程中保持加热温度不变。关于是否应当这样，存在两种不同的观点。一种观点认为，在升华干燥阶段，随着水分的升华，使制品浓度升高，其玻璃化转变温度也会提高，这样升华干燥过程中就可以适当逐渐提高温度，加快升华进行；另一种观点认为，在升华干燥阶段，升华的只是游离在网状结构空隙中的自由水，不会对物料实体的玻璃化转变温度产生影响，因此升华干燥过程中的加热温度仍应保持不变。实际上这两种情况都可能出现，是和冷却固化的情况有关的。

2.2一次干燥中冷阱温度的控制

冷阱位于真空泵进口前，升华产生的水蒸气靠压差的作用到达冷阱，重新结成霜，如果没有冷阱或其温度不够低，就会导致冻干室内水蒸汽压升高，制品升华界面压力和温度都会上升，导致制品融化。对于多数制品的冷冻干燥，冷阱表面温度在-40—-50℃之间已能满足要求。

2.3一次干燥中的真空度

一次干燥中真空度应维持13.33-26.66pa。一般说来，在升华干燥过程中真空度是维持不变的，但也可以采用循环压力法，即控制真空系统的压力在一定范围内上下波动，以期提高干燥速度。大量研究表明，在干燥过程中短期地略微提高干燥室压力（10-20Pa），同时干燥层表面温度维持在接近其允许值，可以缩短干燥时间。但干燥室压力必须低于升华界面压力，而升华界面的压力所对应的升华界面温度必须低于制品在相应浓度下的玻璃化转变温度。在升华过程中，有时可采用向冻干箱内充注气体，以形成对流传热，但这一部分空气量会降低真空度，因此，要对真空度进行控制，使其既能形成恰当的对流传热，又能使制剂表面始终处于匀速干燥的压力状态。

2.4影响干燥效率的因素

在一次干燥过程中，除了制品温度、冷阱温度、干燥室压力影响干燥快慢以外，预冻速度也影响着升华效率。慢冻形成大冰晶，升华后形成大的孔隙，有利于升华进行，干燥速度快；速冻形成细小的冰晶，升华后留下细小的通道，干燥速度慢。但慢冻时，溶质可能发生迁移，以至于在表面形成一层硬壳，阻止升华进行。

近年来发现，在冻干配方中加入5%左右叔丁醇后，冻结时会形成针状结晶，冰晶升华后留下了管状通道，使水蒸气阻力大大减小，升华速率显著提高，节省了时间和能耗。

 3 二次干燥 

二次干燥（解吸干燥）是在较高的温度下对制品加热，使制品中被吸附的部分“束缚水”解吸变成“自由”的液态水再吸热蒸发成水蒸气的过程，加热量主要用于被束缚水的解吸作用和蒸发。由于升华干燥之后，在干燥制品的多孔结构表面和极性集团上结合水的吸附能量很大，因此必须提供较高的温度和足够的热量才能实现结合水的解吸过程。该过程中，制品的含水量不断减少，其玻璃化转变温度是不断提高的，制品温度也可以逐渐提高。

在二次干燥过程中，板层温度至少每小时增加5℃-10℃。成品温度应该迅速升至板层温度或以上，否则制品水分增多且易倒塌。

二次干燥目的虽然是使残存在多孔疏松状固体中的水被去除，但适当的水分（通常1-1.5%）对于保持疫苗结构完整性和活性也是必要的。制品水分过低，菌体表面亲水基团失去保护，会直接与氧接触，影响菌体的存活率。最终板层温度是成品水分含量的一个主要决定因素，其数值不能超过制品的最高允许温度，对于蛋白质药物其最高允许温度一般应低于40℃，对于绝大多数动物用疫苗，最终板层温度应该在25℃-35℃之间。一般细菌性产品最终板层温度为30℃-35℃，病毒性产品为25℃。

 4 密封保存

冻干结束后，通过板层液压升降系统，将半加塞的疫苗瓶在真空状态下密封。使用的管状玻璃瓶和胶塞应配套，将其密封后置45℃水浴24小时，观察疫苗瓶中是否有水被吸入。真空密封的完整性应在温度压力下评估，简单的试验是将成品在45℃水浴24小时，观察疫苗瓶中是否有水被吸入。胶塞应该在135℃干燥4小时，高压灭菌胶塞可使疫苗的水分提高2-5%。